RT-PCR出一段目的基因，為什么要把它先TA克隆呢？為什么不能直接把它連接到相應(yīng)的質(zhì)粒上呢
RT-PCR出一段目的基因，為什么要把它先TA克隆呢？為什么不能直接把它連接到相應(yīng)的質(zhì)粒上呢
確實(shí)可以不一定要TA克隆。你可以在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在引物的5\’端加上酶切位點(diǎn)，比如你選中XXXYYY位點(diǎn)你可以把引物設(shè)計(jì)為AA－XXXYYY－AGCT(AGCT 代表你原來(lái)的引物序列）.我一般在頭上加2個(gè)A，這樣酶切效果好一些。
兩個(gè)引物可以加相同，也可以不同酶切位點(diǎn)。
取決于2點(diǎn)：1。擴(kuò)增區(qū)沒(méi)有該位點(diǎn)，（必須知道你擴(kuò)增區(qū)的序列）2。對(duì)應(yīng)于你的目標(biāo)分子。TA克隆的好處在于選擇靈活，萬(wàn)一一個(gè)位點(diǎn)不好使，同一批質(zhì)粒還可以用其他酶再切。
隨時(shí)可以擴(kuò)增。還有方便下游作業(yè)，比如說(shuō)你要連接兩端PCR產(chǎn)物，先克隆會(huì)比較方便一些。所以2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，你可以根據(jù)情況選用。
ta克隆的優(yōu)缺點(diǎn)
一、缺點(diǎn)：
1、PCR產(chǎn)物的酶切和判斷比較困難。
2、另外酶切連接過(guò)程本身也相當(dāng)?shù)刭M(fèi)時(shí)費(fèi)力。
二、優(yōu)點(diǎn)：
1、克隆PCR產(chǎn)物較簡(jiǎn)便、快捷的方法。
2、不需使用含限制酶序列的引物，不需將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，不需把PCR產(chǎn)物做平端處理，不需在 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。
擴(kuò)展資料：
T-A克隆由于在PCR過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：
1、使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進(jìn)行加A的過(guò)程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。
2、使用不同的Taq酶，在PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，加上72℃ 10分鐘一個(gè)過(guò)程，Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。
PCR產(chǎn)物怎么做TA克隆
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